У молекуларној биологији, добар избор пуфера и припрема за различите кораке изолације ДНК могу бити разлика између преласка на експресију протеина или отварања још једног маки-преп кита за почетак. Упркос њиховој пресудној важности, рецепти за пуфере су често само - рецепти написани без објашњења или образложења за различите компоненте. Један такав пуфер је глукоза-трис-ЕДТА или ГТЕ пуфер.
$config[code] not foundЗа шта се користи ГТЕ?
ГТЕ се користи за ресуспендирање бактеријских ћелијских пелета пре лизирања (разбијања) ћелија и сакупљања плазмидне ДНК унутар. Лизозим, који омекшава ћелијске мембране, често се додаје заједно са ГТЕ пуфером. Постизање хомогене суспензије целих ћелија током овог корака, тако да накнадно додани раствор лизе може доћи до свих ћелија је кључ за добијање добрих приноса ДНК. ГТЕ је дизајниран да то уради док истовремено обезбеђује стабилно окружење за ДНК.
Глукоза за Осмоларност
50 мМ (милимоларни) шећер глукозе се додаје у ГТЕ пуфер да би се одржала осмоларност где је концентрација раствора изван ћелија близу оне унутар ћелија. Ово спречава прерано лизирање ћелија, што може изазвати мање приносе ДНК због агрегације и деградације. Остале компоненте пуфера такође доприносе осмоларности раствора, али је глукоза, као неелектролит, добар избор јер не интерферира са својствима пуфера раствора.
Трис за пХ стабилност
Трис је кратко име за трис (хидроксиметил) аминометан, који је веома чест пХ пуфер. У случају ГТЕ пуфера, кисела со (Трис-ХЦл) је додата у пуфер у концентрацији од 25 мМ. Ово одржава пХ раствора на скоро физиолошком 8.0, идеалном пХ за спречавање киселинске хидролизе (деградације) плазмидне ДНА и нежељених споредних реакција других ћелијских компоненти.
ЕДТА спречава деградацију ДНК
ЕДТА, или етилендиаминететраацетатна киселина, хвата или "хелатира" јоне метала из раствора, спречавајући их да учествују у нежељеним споредним реакцијама. У ГТЕ пуферу, ЕДТА се додаје на 10 мМ. Његова примарна сврха је у пуферу за заокруживање слободног цинка, магнезијума и калцијума, чиме се спречава деградација ДНК одређеним путевима који захтевају те метале.
Неки важни савети
Држите ГТЕ бафер хладним и направите га у малим количинама како бисте спречили раст нежељених бактерија у њему. Шећер и контролисана пХ вредност чине велики медијум за раст. Увек користите пречишћену воду. Вода из славине може имати вишак металних јона из цијеви, што може надјачати способност ЕДТА да ухвати. Ако сумњате на присуство интервентне РНК у вашем узорку, додајте РНасе А на 100 микрограма по милилитру у ваш ГТЕ бафер да бисте елиминисали проблем.
